Häufig gestellte Fragen

Ich möchte mir die Ergebnisse von SepsiTest™ BLAST exemplarisch anschauen, habe aber gerade keine entsprechende Testsequenz zur Hand. Folgenden originalen EMBL Eintrag können Sie mittels der copy-and-paste Funktion ihres Systems schnell und einfach in das Eingabefenster unter dem Reiter "FASTA Sequenz" auf der SepsiTest™ BLAST Startseite kopieren. Versuchen Sie auch nur den Anfang, das Ende oder ein beliebiges mittleres Fragment der Sequenz zu blasten. Bitte beachten Sie aber, dass es nicht kürzer als 200 Basen sein darf! Ob der Header mit kopiert wird oder nicht, spielt keine Rolle.

>embl|AJ233425|AJ233425 Proteus vulgaris 16S rRNA gene (strain DSM 30118)
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Alternativ können Sie sich auch direkt einen Screenshot des entsprechenden Ergebnisses ansehen. Die Testsequenz entspricht exakt einem Eintrag der SepsiTest™ BLAST zugrunde liegenden Datenbank. Daher ist zusätzlich die Position der Testsequenz in einem phylogenetischen Baum gezeigt, der für den vollständigen Referenzdatensatz berechnet wurde. Mehr ...

Wie müssen meine Sequenzen formatiert sein, damit SepsiTest™ BLAST sie analysieren kann? Das System verarbeitet DNA-Sequenzinformation im FASTA und ABI Format, sowie reine DNA-Sequenzinformation.
Bitte beachten Sie, dass eine Reihe von FASTA-ähnlichen Formaten im Umlauf sind. Eine exakte Beschreibung des FASTA Formats finden Sie hier.
Sollte die Eingabe nicht lesbar sein, erhalten Sie eine entsprechende Meldung. Ferner teilt SepsiTest™ BLAST Ihnen ggf. mit, dass die Qualität der Eingabesequenz nicht ausreichend ist (<200 Basen und/oder >5% Ambiguities). Von Sequenzen im ABI Format, werden zuvor noch die Enden geprüft und ggf. gekürzt (Entfernen von N's bzw. von Basen mit unzureichendem Qualitätswert).

In das Eingabefeld unter dem Reiter "FASTA Sequenz" können sowohl Sequenzen im FASTA Format inkl. Header als auch reine DNA-Sequenzen kopiert werden. Beachten Sie aber, dass im letzteren Fall später auch keine beschreibenden Informationen in dem pdf File enthalten sind, das auf der Ergebnisseite zwecks Archivierung generiert werden kann.
Was ist das Besondere an der zugrunde liegenden rRNA-Gen-Datenbank und welchen Umfang weist sie auf? Die zugrunde liegende Referenzdatenbank beinhaltet 7,023 qualitätsgeprüfte, vollständige 16S rRNA-Gen-Sequenzen, die ausschließlich kultivierte Referenzstämme für beschriebene Arten innerhalb der beiden Domänen Bacteria und Archaea umfassen (Yarza et al., 2008). Es handelt sich um die frei verfügbare Datenbank des "All-Species Living Tree" Projekts (basierend auf dem Release 'LTP_s95' vom Oktober 2008 - mit einigen wenigen dokumentierten Veränderungen, siehe unten). Detaillierte Informationen und Downloads finden Sie auf der LTP Projekt Seite.

Zusätzlich wurde die Datenbank mit 342 ausgewählten 18S rRNA-Gen-Sequenzen (Eukarya) supplementiert, welche die kultivierten Vertreter der Pilz-Gattungen Candida, Aspergillus und Cryptococcus repräsentieren. Sollten Sie Interesse an weiteren eukaryontischen Vertretern haben, lassen Sie es uns wissen (info.molzym@bruker.com).

Alle Sequenzen entsprechen den originalen Genbank/EMBL-Einträgen.
Für eine schnelle Übersicht oder die gezielte Suche nach ausgewählten Organismen bieten wir eine alphabetisch geordnete Liste aller Einträge der SepsiTest™ BLAST Datenbank im Excel-Format an - öffnen/download

Im Vergleich zu NCBI-BLAST enthält SepsiTest™ BLAST also keinen Ballast, sondern ist komplett auf die rRNA-Gen-Diagnostik zugeschnitten. Das Vorhandensein von ausschließlich hochwertigen und korrekt klassifizierten (!) rRNA-Gen-Sequenzen in Kombination mit einem zusätzlichen Interpretationslayer, stellt die Ausgabe von ausschließlich relevanten Ergebnissen sicher.
Welche Technologie liegt der Identifizierung von möglichst ähnlichen Sequenzen in einer Referenzdatenbank mittels SepsiTest™ BLAST zugrunde?

SepsiTest™ BLAST basiert auf der weit verbreiteten BLAST-Technologie, die Abschnitte mit einer hohen lokalen Ähnlichkeit auf verschiedenen Sequenzen identifiziert (Altschul et al., 1990) und damit ermöglicht, zu einer Eingabesequenz ähnliche Sequenzen in einer (großen) Referenzdatenbank aufzufinden.
Für die Vermeidung von “falsch-positiven“ Ergebnissen wurde eine minimale absolute Länge des lokalen Alignments und eine minimale relative Abdeckung des Alignments in Bezug auf die Eingabesequenz definiert. Auf diese Weise - und in Kombination mit der qualitativ hochwertigen Referenzdatenbank - bekommen Sie ausschließlich sinnvolle Ergebnisse in der Ergebnisliste angezeigt.
Ich habe eine mir bekannte Sequenz getestet und erwarte keine vollständige Übereinstimmung mit Vertretern in der Referenzdatenbank. Allerdings würde ich zumindest eine Reihe von weniger ähnlichen Sequenzen in der Ergebnisliste erwarten. Treffer werden von SepsiTest™ BLAST nur ausgegeben, wenn in der Referenzdatenbank Sequenzen gefunden werden, die über den von BLAST alignierten Bereich eine Identität von mind. 97% zu der Eingabesequenz aufweisen! Dieser Ansatz soll helfen, die relevanten Informationen schneller zugänglich zu machen, da der Fokus von SepsiTest™ BLAST auf der Identifikation von beschriebenen Mikroorganismen liegt.
Sollten Sie kein positives Ergebnis erhalten, bedeutet dies, dass momentan keine ausreichend ähnliche Sequenz in der Datenbank enthalten ist. Für erste weiterführende Betrachtungen empfehlen wir, in diesen Fällen auf Anwendungen wie NCBI-BLAST auszuweichen. Gerne machen wir Ihnen auch ein Angebot, sollten Sie Hilfe bei der exakten Klassifikation Ihrer Sequenzen benötigen.

Für eine schnelle Übersicht oder die gezielte Suche nach ausgewählten Organismen bieten wir eine alphabetisch geordnete Liste aller Einträge der SepsiTest™ BLAST Datenbank im Excel-Format an - öffnen/download
Was muss ich in Bezug auf die von SepsiTest™ BLAST angegebenen Identitäten unbedingt beachten? 1. Sequenzierfehler oder nicht aufgelöste Basen in der Eingabesequenz verringern zwangsläufig die angegebenen Identitäten auf artifizielle Weise. Die reale Identität kann also unter Umständen höher sein als angegeben.

2. Die für partielle rRNA-Gen-Eingabesequenzen angegebenen Identitäten betreffen nur den berücksichtigten Teilbereich des Gens. Die angegebenen Werte entsprechen nicht notwendigerweise der Identität, die sich aus der Analyse des gesamten Gens ergeben würde. Das rRNA-Gen weist eine ausgeprägte positionelle Variabilität auf, konservierte Regionen wechseln sich mit weniger konservierten Regionen ab. Somit können sich je nach sequenzierter Region des gesamten Gens sogar die ermittelten Identitäten zu nahverwandten Organismen unterscheiden.
Die Sortierung Ergebnisliste entspricht nicht meiner Erwartung. Arbeitet das Tool ungenau? Definitiv nein! Im Bereich des Machbaren liefert SepsiTest™ BLAST äußerst exakte Ergebnisse.

Ein häufig völlig unterschätzter Aspekt ist die Qualität der hinterlegten Sequenzen in den öffentlichen Datenbanken und insbesondere die Qualität von deren Annotation (also die Benennung/Einordnung der Sequenzen). Vereinzelte Fehler führen umgehend zu einem Schneeballeffekt, d.h. neue Sequenzen werden basierend auf zuvor ungenau klassifizierten Sequenzen annotiert (usw.). Dies kann unter Umständen dazu führen, dass nach der jahrelangen Nutzung von NCBI-BLAST Erwartungshaltungen aufgebaut werden, die beispielsweise durch eine höherwertige phylogenetische Analyse gar nicht mehr gedeckt werden. Denn nur ein Bruchteil der öffentlich verfügbaren rRNA Sequenzen ist taxonomisch ausreichend beschrieben. SepsiTest™ BLAST dagegen, beinhaltet nur vollständig beschriebene Typstämme. Da diese eigentlich hochrelevanten Treffer in der Liste der NCBI-BLAST Ergebnisse aber oft untergehen, kann es zu zunächst "unerwarteten" Resultaten kommen.

Ein weiterer Grund sind die grundsätzlichen Limitationen bei der Identifikation von Mikroorganismen abseits des aufwendigen polyphasischen Ansatzes. Die Auflösung eines jeden Ansatzes ist begrenzt, insbesondere wenn nur anhand von einzelnen Kriterien identifiziert werden soll (z.B. anhand eines ausgewählten genetischen Markers). Dies wird aber nur selten bei der Betrachtung der Ergebnisse in ausreichendem Maße berücksichtigt. Bedenken Sie immer, dass ein gewisses "Rauschen" auf den Ergebnissen liegt. Die Ursachen hierfür sind vielfältig und reichen von grundlegenden biologischen Aspekten (Operondiversität etc.) bis hin zur technischen Umsetzung selber, die aufgrund der Komplexität der Fragestellung (bedenken Sie das offene Spezies-Konzept in der Mikrobiologie) immer nur Näherungen liefern kann.
Ich habe noch offene Fragen zu SepsiTest™ BLAST ... Senden Sie einfach eine Mail an info.molzym@bruker.com. Wir helfen Ihnen gerne!